Μετά από συνεννόηση με τον Πατριάρχη Γρηγόριο Ε', τους φιλικούς και τον Επίσκοπο Σαλώνων Ησαϊα , στις 27 Μαρτίου 1821 στο ιστορικό μοναστήρι του Οσίου Λουκά, την Αγία Σοφία της Ρούμελης, έγινε η επίσημη έναρξη του Αγώνα. Ο Σαλώνων Ησαϊας ευλόγησε τα όπλα του Εθνικού Αγώνος, σε όλη τη διάρκεια του οποίου οι μοναχοί χειρίστηκαν το καριοφύλλι καλύτερα από το θυμιατό και αναδείχθηκαν διαλεχτοί πολεμιστές και καπεταναίοι. Η Επανάσταση στη Βοιωτία ξεκίνησε με τον Επίσκοπο Σαλώνων να καταθέτει τα άμφια του, και με το Πανουργιά να υψώνει τη σημαία της Επανάστασης στα Σάλωνα, με το Διάκο και το Δυοβουνιώτη στο Ζητούνι. Στη σύγκρουση με το στρατό του Ομέρ Βρυώνη στη Χαλκομάτα, ο Σαλώνων Ησαϊας ο πρώτος Δεσπότης και πρωτοπόρος κληρικός του αγώνα έπεσε στη μάχη για την εθνική ανεξαρτησία. Κέντρο δράσεως του Οδυσσέα Ανδρούτσου η Μονή, διέθεσε τεράστια περιουσία στους καπεταναίους της.
Η ζωή του μοναστηριού από την ίδρυσή του μέχρι και σήμερα ταυτίζεται με την ιστορία του Ελληνικού Έθνους. Τους δύο πρώτους αιώνες της ύπαρξής της η Μοναστική κοινότητα αποτελούσε πηγή Χριστιανικής πίστης και θείας ευλογίας.
Κατά την διάρκεια της Φραγκοκρατίας, όταν στα 1204, μετά την Δ Σταυροφορία η Κωνσταντινούπολη έπεσε στα χέρια των Φράγκων, ο Βονιφάτιος ο Μομφερρατικός, βασιλιάς της Θεσσαλονίκης, κατέβηκε στη Στερεά Ελλάδα, έδιωξε τους Ορθόδοξους Έλληνες μοναχούς από τον Όσιο Λουκά και εγκατέστησε Λατίνους, οι οποίοι λήστεψαν και γύμνωσαν τη Μονή. Στη συνέχεια, ο πρίγκιπας της Αχαΐας Γοδεφρείδος Β Βιλεαρδουίνος (1218-1245) λεηλάτησε τους εναπομείναντες θησαυρούς της Μονής και τους μετέφερε στη Ρώμη.
Στα χρόνια του Δουκάτων Αθηνών-Θηβών (1205-1308) η οικογένεια των ντε λα Ρος κατείχε το μοναστήρι σαν αναπόσπαστο κληροδότημά της. Οι Καταλανοί, ύστερα από τη νίκη τους στην Κωπαΐδα (15 Μαρτίου 1311) και την κατάληψη της Λιβαδειάς, πραγματοποίησαν μία ακόμη λεηλασία. Όμως, όταν επισκέφθηκε το μοναστήρι ο πρώτος περιηγητής το 1436, ο λόγιος της Δύσης Κυριακός ο Αγκωνίτης, βρήκε τη Μονή σε καλή κατάσταση και την ξεχώρισε από όλα τα μοναστήρια της Ελλάδος.
Κατά την Τουρκοκρατία, από το 1460 που υποτάχθηκε η Βοιωτία στους Τούρκους μέχρι την ημέρα της λευτεριάς, το μοναστήρι αγωνίστηκε για την ύπαρξή του, γιατί κινδύνεψε με αφανισμό επανειλημμένα από τη βουλιμία των Τούρκων κατακτητών. Παρ' όλα αυτά ο Γάλλος περιηγητής Ιάκωβος Σπον, που επισκέφθηκε τη Μονή το Φεβρουάριο του 1676, αναφέρει ότι ήταν «ακμαιότατη και καλλίστη», ενώ ο Άγγλος περιηγητής Τζωρτζ Ουέλερ που την επισκέφθηκε τον ίδιο χρόνο, γοητεύτηκε τόσο πολύ, ώστε ήθελε και αυτός να ασκητέψει εκεί.
Μεσολάβησαν η ανταρσία των Αλβανών του Μοριά (1677), η εξέγερση των Μανιατών και των Ακαρνάνων αρματολών (1685), η επανάσταση της Βοιωτίας και της Φωκίδας (1687), με οδυνηρές συνέπειες για το μοναστήρι.
Στον πόλεμο Τούρκων και Ενετών (1714-15) καταληστεύτηκε για μία ακόμη φορά. Μετά την αποτυχία της εξέγερσης Παπαζώλη-Ορλώφ το 1770, ο μεγάλος αρματολός της Ρούμελης Ανδρούτσος μετέβαλε το μοναστήρι σε στρατόπεδο του, με αποτέλεσμα να υποστεί η Μονή την εκδικητική μανία των Τούρκων.
Στην Επανάσταση του 1821 η Μονή έγινε και πάλι το επαναστατικό ορμητήριο της Ρούμελης. Ο Δεσφινιώτης Ησαΐας, Δεσπότης Σαλώνων, ευλόγησε στις 27 Μαρτίου 1821 τα ρουμελιώτικα όπλα και κήρυξε επίσημα την Επανάσταση.
Μετά την πυρπόληση της Λιβαδειάς τον Ιούνιο του 1821 από τον Ομέρ Βρυώνη, οι διασκορπισμένοι επαναστάτες συγκεντρώθηκαν στον Όσιο Λουκά και ξεκίνησαν για την επιστροφή στο Μοριά. Από τον Όσιο Λουκά πάλι, ξεκίνησε λίγους μήνες αργότερα ο Οδυσσέας Ανδρούτσος και ξαναπήρε τη Λιβαδειά. Κατά την κάθοδο του Δράμαλη οι Τούρκοι αποτελείωσαν ο,τι απέμεινε στον Όσιο Λουκά (1822, 1823). Όμως και πάλι το μοναστήρι επιβίωσε,
Το 1943 υπέφερε και πάλι από τους κατακτητές Γερμανούς.
