Μετά τη διαίρεση της Ρωμαϊκής Αυτοκρατορίας το 395 μ.Χ., η Φθιώτιδα εντάχθηκε οριστικά στο Ανατολικό Ρωμαϊκό Κράτος, γνωστό και ως Βυζαντινή Αυτοκρατορία, υπό την πνευματική και πολιτική ηγεσία της Κωνσταντινούπολης. Από τον 7ο αιώνα και έπειτα, εντάχθηκε στο διοικητικό πλαίσιο του θέματος Ελλάδος, το οποίο εκτεινόταν από τον Πηνειό ποταμό έως την Κόρινθο, με πρωτεύουσα τη Θήβα.
Η θρησκευτική σημασία της περιοχής επιβεβαιώνεται ήδη από τον 5ο αιώνα, όταν οι επίσκοποι Λαμίας (Σεκουδιανός) και Υπάτης (Παυσιανός) συμμετείχαν στη Γ' Οικουμενική Σύνοδο της Εφέσου το 431 μ.Χ. Στην 8η Οικουμενική Σύνοδο (869 μ.Χ.), η Λαμία αναφέρεται με το όνομα Ζητούνι, με παρόντα τον επίσκοπο Γεώργιο, ενώ η Υπάτη αναφέρεται ως Νέα Πάτρα.
Κατά τα χρόνια του αυτοκράτορα Ιουστινιανού Α’ (527–565), ο γεωγράφος Ιεροκλής καταγράφει στο «Συνέκδημο» τρεις πόλεις της Φθιώτιδας — τη Λαμία, την Υπάτη και τον Εχινό (Εχίναιον) — οι οποίες ανήκαν στην επαρχία της Θεσσαλίας.
Η περιοχή υπέστη πολλαπλές επιδρομές από σλαβικά φύλα μεταξύ 517 και 675 μ.Χ., γεγονός που οδήγησε σε εκτενείς οχυρωματικές ενισχύσεις στη Λαμία και την Υπάτη. Ιδιαίτερα καταστροφικός υπήρξε ο σεισμός του 551 μ.Χ., που έπληξε τις πόλεις της Λαμίας, της Σκάρφειας και του Αχινού.
Στα τέλη του 9ου αιώνα, ο βούλγαρος τσάρος Συμεών Α’ επιτέθηκε στη Φθιώτιδα κατά τη διάρκεια των εκστρατειών του μέχρι την Κόρινθο. Ωστόσο, καθοριστική για την περιοχή υπήρξε η εκστρατεία του διαβόητου τσάρου Σαμουήλ (τέλη 10ου αιώνα), ο οποίος, κατά την επιστροφή του από την Πελοπόννησο, υπέστη σοβαρή ήττα το 995 ή 997 μ.Χ. κοντά στον Σπερχειό ποταμό (μεταξύ Κομποτάδων και Φραντζή), από τα βυζαντινά στρατεύματα του στρατηγού Νικηφόρου Ουρανού. Ο Σαμουήλ και ο γιος του, Ραντομίρ, διέφυγαν με δυσκολία μέσω της Πίνδου προς την Αχρίδα.
Η σημασία της Φθιώτιδας αποδεικνύεται και από την επίσκεψη του αυτοκράτορα Βασιλείου Β’ του Βουλγαροκτόνου στη Λαμία το 1018, μετά την οριστική ήττα των Βουλγάρων. Όμως οι ταραχές δεν σταμάτησαν εκεί. Το 1040 σημειώθηκε νέα βουλγαρική επιδρομή υπό τον Πέτρο Ντελεάν, ενώ οι Νορμανδοί λεηλάτησαν την περιοχή δύο φορές, το 1082 και το 1147.
Η Φθιώτιδα, αν και όχι στο επίκεντρο των πολιτικών εξελίξεων του Βυζαντίου, βίωσε έντονα τις συνέπειες των μεγάλων στρατηγικών και στρατιωτικών ανακατατάξεων του μεσαίωνα, αποτελώντας κομβικό σημείο άμυνας και διελεύσεων στο χώρο της κεντρικής Ελλάδας.